腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）無論在體內和體外試驗中均被廣泛應用于基因轉導實驗。AAV可以感染大量種類的哺乳動物細胞，在人體內只產生極低的免疫原性，這些特點使重組AAV成為當今應用于基因治療的高效病毒載體。在基因治療的臨床前和臨床階段的研究中，可通過Baculovirus-AAV嵌合病毒載體高效且大規(guī)模生產重組AAV以符合劑量和安全性要求。

利用桿狀病毒（Baculovirus）生產重組AAV需要將兩種桿狀病毒共轉導昆蟲Sf9細胞。第一種桿狀病毒表達位于兩個AAV ITR元件之間的目的基因，第二個桿狀病毒表達AAV rep和cap基因。為制備兩種桿狀病毒，每種桿狀病毒的表達框均被克隆至一個桿狀病毒轉移質粒。該質粒的整個表達框與慶大霉素（Gentamycin）抗性基因位于質粒上的兩個Tn7轉座子末端序列之間（Tn7L和Tn7R）。該質粒被轉化至帶有桿粒（Bacmid）和輔助載體的大腸桿菌。桿?？梢员豢醋饕粋€特別巨大的質粒，包含了修飾過后的桿狀病毒基因組序列。該序列上帶有l(wèi)acZ基因以及位于該基因內部的attTn7位點。因此轉移質粒上兩個Tn7之間的序列通過Tn7轉座酶與桿粒重組后將插入lacZ基因，隨后通過慶大霉素抗性篩選和藍白篩選即可獲得重組成功的大腸桿菌。從大腸桿菌提取的桿粒純化后用于轉染昆蟲Sf9細胞。

我們的baculovirus-AAV嵌合病毒載體表達的定制目的基因位于兩個AAV ITR元件之間。利用該載體生產的重組桿狀病毒與表達AAV rep和cap基因的輔助桿狀病毒可共轉導至昆蟲細胞，然后利用昆蟲細胞中大規(guī)模制備重組AAV。

使用AAV轉導宿主細胞時，兩個ITR之間的外源DNA及病毒基因組一同進入細胞，線性雙鏈DNA基因組以游離體DNA的形式存在于細胞核中。在分裂細胞中，由于游離體DNA不跟隨細胞復制，AAV基因組將隨著細胞分裂逐漸丟失，因此在整體細胞中被稀釋。重組AAV的DNA隨機整合宿主基因組的現(xiàn)象是非常罕見的，這對于需要考慮外源DNA插入宿主基因組引發(fā)致癌風險的基因治療來說是相當適用的特點。

AAV的另一個應用優(yōu)點在于，在大多數(shù)情況下，可以在生物安全1級（BSL1）設施中完成操作。重組AAV是復制缺陷型的，不會引起炎癥反應和引發(fā)人類疾病。

人們已從自然界中鑒定出許多AAV病毒株，根據(jù)病毒表面衣殼蛋白的不同抗原將它們分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的組織嗜性（即感染組織特異性）。當我們的AAV載體使用不同的衣殼蛋白包裝病毒時，則會賦予病毒不同的血清型。目前我們使用Baculovirus-AAV嵌合病毒載體包裝的AAV提供以下幾種血清型：AAV1、2、6、8和9。AAV包裝時的ITR序列來源于AAV2，這是一種常用的AAV載體構建方式，不影響血清型。另一方面，決定血清型的衣殼蛋白基因由Rep/Cap包裝質粒編碼。關于AAV的更多血清型信息，請參照下表。

關于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參照以下文獻。

Baculovirus-AAV嵌合病毒載體可以用于高效地并大規(guī)模生產重組AAV。我們的載體系統(tǒng)經過優(yōu)化，可以在大腸桿菌中以高拷貝數(shù)形式復制，中間需要包裝出高滴度的重組桿狀病毒，最后制備的AAV具有很低的安全風險。

高效與易放大：Sf9昆蟲細胞可以在大型生物反應器中以高密度的懸浮細胞方式培養(yǎng)，因此用其生產AAV，對比傳統(tǒng)利用哺乳動物細胞制備AAV的方法更高效、生產上更易放大規(guī)模。

安全性高：桿狀病毒對于哺乳動物和植物是非致病性的，并且不能在昆蟲細胞外復制。因此，使用昆蟲細胞株的生產環(huán)境僅需要最低的生物安全等級。此外，昆蟲細胞的培養(yǎng)使用的是無血清培養(yǎng)基，排除了任何動物源成分，進一步強化了該載體系統(tǒng)的生物安全性。使用該系統(tǒng)生產的重組AAV仍然是復制缺陷型的，不會引發(fā)任何人類疾病。

對宿主基因組造成破壞的低風險性：在轉導進入靶細胞后，AAV基因組在細胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風險，使其成為人類體內實驗的理想載體。

高病毒滴度：利用我們的baculovirus-AAV嵌合病毒載體可以包裝成高滴度的AAV病毒。經Sf9昆蟲細胞生產的AAV病毒其滴度可達到>10¹³ GC/ml。

宿主范圍廣：針對不同來源的常用哺乳動物（如人、小鼠和大鼠）細胞和組織，將我們的AAV載體包裝成對其具有親和性的血清型，可輕易實現(xiàn)高效轉導。但是，某些類型的細胞仍然難以轉導（見下文不足之處），這與所用的血清型有關。

體內外實驗均有效：我們的載體不僅能用于體內活體動物實驗，還具有體外細胞轉導能力。

載體容量?。?/strong>AAV是我們所有病毒載體系統(tǒng)中裝載量最小的。AAV的兩個ITR之間所能容納的最大序列長度是4.7 kb，允許使用者插入~4.2 kb的目的序列。

難以轉導特定類型的細胞：當利用合適的血清型進行包裝時，我們的AAV載體系統(tǒng)可以轉導很多不同類型的細胞，包括非分裂細胞。不同AAV血清型對不同類型的細胞具有不同的嗜性，針對某種特定類型的細胞需要特定血清型。 

技術復雜：通過baculovirus-AAV表達系統(tǒng)生成重組AAV需要多個步驟，包括克隆目的基因至桿狀病毒轉移載體、從轉移載體制備重組桿粒、桿粒轉染并使用桿狀病毒轉導昆蟲細胞等，這些步驟相對于傳統(tǒng)的三質粒轉染法生產AAV具有更高的技術復雜性、花費時間也更長。通過訂購我們的基于baculovirus-AAV嵌合病毒載體的AAV包裝服務可以輕松解決這些問題。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Promoter: The promoter that drives your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Tn7L: Tn7 transposon left terminal element. It is recognized by Tn7 transposase. DNA flanked by Tn7R and Tn7L can be transposed by Tn7 transposase into attTn7 docking sites.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Tn7R: Tn7 transposon right terminal element. It is recognized by Tn7 transposase. DNA flanked by Tn7R and Tn7L can be transposed by Tn7 transposase into attTn7 docking sites.

Gentamicin: Gentamicin resistance gene. It allows for drug selection of E. coli carrying recombinant bacmids.